1 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

На искусственных питательных средах можно культивировать

Содержание

На искусственных питательных средах можно культивировать

  • Что такое Научный парк
  • Как выполнить работу в Научном парке
  • Служебное жилье
  • Нормативные документы
  • Конференция Научного парка 2014
  • Конференция Научного парка 2015
  • Семинар Биобанка 2016
  • Конференция Современные методы термического анализа
  • Центры
  • Оборудование
      • Исследовательские стенды
      • Обновление приборной базы
      • Загрузка оборудования
      • Вычислительные ресурсы
          • Программное обеспечение
          • Компьютерные классы
          • Вычислительные ресурсы
          • Исследовательские методики
          • Аттестованные методики
          • Публикации
          • Статистика по публикациям
          • Отзывы
          • Текущие проекты
          • Статистика
          • Загрузка оборудования
          • Конференция Научного парка 2014
          • Конференция Научного парка 2015
          • Конференция Современные методы термического анализа
          • Семинар Биобанка 2016
          • Дирекция Научного парка
          • Директора ресурсных центров
          • Служба поддержки
          • Заявки
              • Заявка на измерения для внешних пользователей
              • Заявка на стажировку
              • Заявка на ознакомительную экскурсию

              Методики культивирования микроорганизмов

              Культивирование инфузорий рода Paramecium

              Культуры поддерживаются в стеклянных пробирках объемом 14 или 16 мл при температуре 10˚С. Среда для культивирования: 0,04 % отвар салатных листьев на дистиллированной воде, инкубированный с пищевыми бактериями. Кормление культур инкубированной салатной средой производят раз в две недели с частичной или полной заменой среды.

              Культивирование различных гетеротрофных протистов

              Культуры поддерживаются в культуральных флаконах объемом 50мл или чашках Петри диаметром 60 или 90 мм, при температуре 18˚С.

              Культивирование крупных лобозных амеб («proteus-like»)

              Культуры поддерживаются в стеклянных чашках Петри диаметром 90 мм или бактпечатках, при температуре 18˚С. Среда для культивирования Прескотт-Карриер, пищевые объекты – инфузории Tetrahymena pyriformis. Кормление культур и смена среды через день, пересадка со сменой среды раз в неделю. Возможно поддержание культур на среде Прескотта-Карриера с рисовыми зернами и инокулированной в среду смесью инфузорий Colpidium sp. и жгутиконосцев Chilomonas sp.

              Культивирование микроскопических зеленых водорослей и цианобактерий коллекции CALU

              Штаммы коллекции поддерживаются в виде растущих или покоящихся культур на жидких или агаризованных синтетических питательных средах.

              Основные питательные среды 1, 3, 6, 12, 16 и 17 разработаны в лаборатории микробиологии (Громов Б.В., Титова Н.Н, 1983).

              Методика выведения клонов парамеций из природных популяций

              1. Образец природной воды с находящимися в ней микроорганизмами тщательно обследуют под бинокуляром. В микроаквариум («солонку») вносят 0.5-1 мл исследуемой воды без инфузорий. С помощью капиллярной пипетки отбирают клетки парамеций и помещают в микроаквариум.

              2. Клетки парамеций необходимо отмыть от сопутствующих микроорганизмов. Для этого с помощью капиллярной пипетки клетки из исходного микроаквариума переносят по одной в микроаквариум с бактериальной средой, используемой для кормления парамеций (0.5-1 мл). Процедуру повторяют еще 2-4 раза.

              Методика обогащающего культивирования и выделения клонов голых лобозных амеб из природных водных сообществ (качественные пробы)

              1. Образец донного грунта и/или воды из водного экотопа отбирают в стерильную посуду и как можно скорее транспортируют в лабораторию.

              2. Для выделения микроорганизмов подготавливают необходимое количество флаконов для культивирования объемом 50 мл и/или чашек Петри диаметром 90 мм. Следует учитывать, что в силу высокого уровня пространственной микрогетерогенностидонных местообитаний увеличение объема высеваемого грунта позволит охватить больше имеющихся в данном экотопемикрониш, вследствие чего увеличить фракцию видов, обнаруживаемых этим методом (в случае, если задача исследования подразумевает наиболее полный охват состава данного сообщества).

              Методика тестирования бактерицидной и бактериостатической активности различных веществ

              Для проведения экспериментов используется культура бактерий в стационарной фазе роста.

              Перед началом эксперимента определяется исходная плотность культуры с использованием спектрофотометра.

              Экспериментальное воздействие осуществляется в соответствии с конкретными характеристиками тестируемого вещества.

              Оценка результатов воздействия производится путем высева тестируемой культуры на чашки Петри с агаризованной средой LB. Чашки инкубируют в течение суток при температуре 37°С и затем подсчитывают количество сформировавшихся колоний (в опыте и контроле).

              Методика инфекции инфузорий рода Paramecium бактериями рода Holospora

              1. Клетки парамеций, содержащие инфекционные частицы бактерий, концентрируют до объема 1-1.5 мл в пробирке «эппендорф».

              2. К полученному объему клеток добавляют детергент NonidetNP40 концентрации 1% из расчета: 1 мл клеток – 100 мкл 1% детергента; интенсивно взбалтывают.

              3. Содержимое лопнувших клеток вместе с инфекционными частицами бактерий осаждают центрифугированием (6000 об/мин х 5 мин).

              Современный подход к культивированию микроорганизмов и культур клеток

              Содержание статьи:

              Большинство научных исследований в области биологии и медицины проводятся не на живых организмах, а «в пробирке». Клеточные культуры и культуры микроорганизмов являются наиболее простым и удобным модельным объектом, позволяющим как тестировать на них воздействие извне, так и исправлять ошибки внутри клетки. Благодаря исследованиям в области клеточного редактирования постепенно становится возможным лечение многих генетических заболеваний. Но каким образом мы можем добиться культуры, максимально соответствующей требованиям к модели для сложных экспериментов? Рассмотрим наиболее популярные современные способы выращивания микроорганизмов и культур клеток.

              Общее понимание культивирования

              Культивирование как микроорганизмов, так и отдельных клеток – это выращивание изъятого из определенной среды материала в лабораторных условиях. Выращенная таким образом подборка единообразных микробов или клеток уже может называться культурой.

              Для того, чтобы выращивание прошло успешно, требуется наличие определенного оборудования, а также соблюдение условий, необходимых для роста и созревания культуры. Стандартно для культивирования используются:

              • Питательная среда, на которой будущая культура должна расти.
              • Факторы роста – питательные вещества, используемые клетками.
              • Посуда, включающая в себя стерильные чашки Петри, инструменты для переноса клеток на среду и др.
              • Дополнительное оборудование: термостаты, аппараты для ферментации и другие.

              Также в процессе культивирования от лаборатории требуется соблюдение условий роста для каждой конкретной культуры. Ввиду того, что как клетки, так и микробы, требуют для себя условий, приближенных к естественным, в лаборатории должны поддерживаться различные условия роста при наличии разных культур. Основные условия: приемлемая для культур температура, влажность, давление, постоянная подача кислорода (для аэробных бактерий) или исключение доступа к кислороду (для анаэробных). (Рекомендуем статью: «Флуоресцентная микроскопия»)

              Факторы роста

              Факторами роста называют все питательные вещества, которые требуются бактериям и клеткам для оптимального роста и развития. В случае если сама среда не обладает достаточным количеством нужных элементов, их добавляют извне. При этом количество строго регулируется в зависимости от требований к конечной культуре.

              К наиболее часто использующимся в современном лабораторном культивировании факторам роста относятся:

              • Аминокислоты. Отдельным микроорганизмам или группам клеток требуются дополнительные аминокислоты извне. При этом требоваться может только одна кислота, например, лейцин и аргинин для стрептококков.
              • Пуриновые или пиримидиновые основания. Также используются и их производные (аденин, гуанин и др.).
              • Витамины. Они требуются для того, чтобы поддерживать работу коферментов, участвующих в метаболизме как клеток, так и бактерий.

              В зависимости от типа культивируемых клеток или бактерий, фактор роста может как входить в состав питательной среды, так и вноситься извне.

              Питательные среды и требования к ним

              Питательная среда – это пространство, в котором находится необходимая группа клеток или бактерий. Среды бывают очень разными, в том числе и узкоспециализированными, для роста наиболее привередливых микроорганизмов. Однако существуют и общие требования, предъявляемые ко всем средам без исключения:

              1. Питательность. Среда должна содержать все необходимые вещества, которые используются бактериями для роста и не могут быть синтезированы ими без среды.
              2. Нужный уровень pH. Это требуется для регулирования проницаемости мембраны клетки и, как следствие, уровень питательных веществ, попадающих внутрь.
              3. Уровень осмотического давления, равный уровню давления в культивируемой клетке.
              4. Оптимальный для конкретной бактерии уровень влажности.
              5. Окислительно-восстановительные качества. Наибольшие различия требований по данной характеристике существуют при культивировании аэробов и анаэробов.
              6. Единый состав среды. Каждая конкретная среда должна иметь одинаковое количество веществ, чтобы не было вариативности в результатах культивирования.

              При этом питательные среды могут значительно различаться по всем остальным характеристикам. Они могут быть как натуральными, так и синтезированными искусственно, а также жидкими, полужидкими или плотными.

              Условия роста

              Рост микроорганизмов и клеток невозможен без соблюдения определенных условий, таких как температура, влажность, давление, свет и аэрация (насыщение кислородом). Существуют микроорганизмы, которые имеют диаметрально противоположные требования по условиям роста. Для решения проблемы условий при культивировании различных клеток или микроорганизмов используется специальная аппаратура с камерами, внутри которых поддерживается нужный уровень температуры, света или давления. В одном таком устройстве, но в разных камерах, может быть одновременно несколько чашек Петри с материалом, имеющим различные требования по условиям роста. (Рекомендуем статью: «Инновационные технологии для поиска и разработки новых лекарств»)

              Стерилизация посуды, сред и окружения

              Одним из наиболее важных требований к процессу культивирования, является отсутствие загрязнений на оборудовании, при помощи которого происходит выращивание. Этого добиваются, проводя мероприятия по стерилизации. Стерилизация может проводиться несколькими способами, наиболее известные и используемые в современных лабораториях:

              • Прокаливание. Экспресс-метод устранения микробиологического загрязнения через нагрев, может выполняться на спиртовке. Однако данный метод не может быть использован с чем-то, кроме игл и петель для переноса материала.
              • Кипячение. Данный метод широко используется для устранения микробов, но споры бактерий он не устраняет.
              • Сухожаровая стерилизация. Проводится в сушильном шкафу, наиболее часто используется для лабораторной посуды.
              • Автоклавирование под давлением. Один из самых популярных и универсальных методов, однако многие материалы и среды разрушаются при использовании автоклавов.

              Основным моментом в современном культивировании клеток и микроорганизмов, всегда будет являться неуниверсальность методик. Из-за большого разнообразия объектов культивирования, всегда будет необходимость подбирать наилучшие условия для конкретного объекта.

              1. Культивирование микробов на искусственных питательных средах. Свойства и состав искусственных питательных сред. Классификация искусственных питательных сред по назначению.

              Питательной средой называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

              Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям:

              содержать все необходимые для размножения определённых микробов вещества в легкоусвояемой форме (источники углерода, азота, кислорода, водорода, неорганические соединения, факторы роста),

              иметь оптимальные влажность, вязкость, pH,

              быть изотоничной и по возможности прозрачной.

              По назначению выделяют искусственные питательные среды:

              • Элективные (селективные) – на которых лучше растёт какой-то определённый микроорганизм (напр., висмут-сульфитный агар для рода Salmonella)

              • Среды обогащения – стимулируют рост какого-то определённого микроорганизма, ингибируя рост других (напр., среда, содержащая селенит натрия, таурохолевокислый натрий и бриллиантовый зелёный, стимулирует рост родаSalmonella и ингибирует рост E. Coli)

              • Дифференциально-диагностические — для изучения и идентификации отдельных групп, видов бактерий, биоваров (напр., среды Левина, Плоскирёва – для диагностики дизентерии, род Shigella, от других представителей кишечной группы)

              • Консервирующие – для сохранения патогенных микроорганизмов живыми в клиническом материале при их пересылке.

              2. Клеточный иммунный ответ: спонтанный, индуцированный, гзт. Медиаторы и эффекторные реакции клеточного иммунного ответа.

              Клеточный иммунный ответ подразумевает формирование клона лимфоцитов (К-лимфоциты, цитотоксические лимфоциты), способных разрушать клетки мишени, мембраны которых содержат чужеродные материалы (например, вирусные белки).

              В отличие от гуморального иммунитета кот осущ-ся при помощи АТ, клеточный иммунитет подразумевает защиту организма при помощи клеток иммунной системы. Клеточный иммунитет обеспечивает сзащиту 3мя основными способами: 1)активируя антиген-специфические Т-лимф., кот распознают и уничтожают чужеродные АГ. 2)активируя макрофаги и Т-киллеры, кот разрушают внутриклеточные патогенны. 3)стим. секрецию цитокинов, кот обеспечивают согласованную реакцию различных клеток иммунной системы.

              Клеточный иммунный ответ направлен в основном против микроорганизмов невосприимчивых к действию фагоцитов или поражающих другие клетки (вирусов, внутриклеточных грибов), а также против опухолевых клеток. Большое значение имеет в реакциях отторжения тканей.

              1. Микрофлора воздуха. Источники и пути попадания патогенных микробов в воздух. Санитарно- показательные микробы воздуха. Методы санитарно-бактериологической оценки воздуха.

              Воздух как среда обитания менее благоприятна для микрооргнизмов, чем почва и вода, т.к. в нем не содержится или мало содержится питательных веществ. Состав микрофлоры воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды, а также от времени года и метеорологических условий. Видовой состав микробов довольно разнообразен. Чаще всего это спороносные микробы, а также сарцины, дрожжи, пигментообразующие бактерии, актиномицеты и плесневые грибы. Распространение патогенных и условно-патогенных бактерий воздушным путём связано с их устойчивостью к высушиванию. Патогенные микроорганизмы попадают в воздух из мокроты и слюны при кашле, разговоре и чихании. Таким воздушно-капельным путем происходит заражение многими острыми репираторными заболеваниями, гриппом, корью, коклюшем, дифтерией, легочной чумой. Также распространение может осуществляться «пылевым» путем. Когда выделение больного высыхает образуются частички пыли с микроорганизмами, потоками воздуха они могут разноситься. Пылевой способ играет особую роль в эпидемиологии туберкулеза, дифтерии, туляремии и др. заболеваний. Санитарно-бактериологическая оценка воздуха: микробное число – количество микробов в 1 куб.метре воздуха. Для определения микробного числа воздуха изпользуют метод Коха (чашечный или седиментационный), так же используют метод Кротова ( аспирационный мотор в аппарате Кротова крутится с определенной скоростью и засасывает воздух сквозь щель на чашку Петри, при этом происходит посев микробов. Затем подсчитывают число колоний), и метод Дьяконова ( пропускают воздух через стерильный физ.раствор, затем засевают 1 мл р-ра на чашку Петри ии ставят в термостат, считают число колоний). Санитарно-показательные микробы воздуха: альфа и бетта стрептококк, золотистый стафилококк. Среда для посева – кровяной агар.

              Культивирование вирусов в питательных средах

              Культивирование вирусов представляет собой их выращивание в искусственных условиях. Для этого культиваторы заражают животных, либо ткани и клетки. Такое мероприятие проводят в целях диагностики, при проведении экспериментов, с целью изготовления противовирусных вакцин.

              Культивирование вируса впервые было совершено Гальтье в 1879 году. Он культивировал вирус бешенства, заразив мозг кролика вирусом бешенства, полученным у больной собаки. Ученым Левенштейном была обнародована информация о возможности передачи вируса герпеса от человека кролику.

              Репродуцирование вирусом осуществляется исключительно в живых клетках. По этой причине для того, чтобы они накопились, их заражают вирусами. После заражения вирус адаптируется к новому организму. Адаптация вируса проходит тем легче, чем ближе новая среда.

              Чтобы репродукция прошла на лучшем уровне используют чувствительную систему, а заражение проводят свежим, но разведенным материалом. Это объясняется тем, что инактивированный вирус может приостанавливать скорость размножения вирионов. Система, в которой осуществляется репродукция, называется пермиссивной. Но, однако для каждого вируса пермиссивная система может приобрести статус непермиссивной. Это будет возможно в случае изменения условий культивирования. К примеру, таким условием являются температурные скачки.

              Культивирование вируса на животных осуществляется только в том случае, ели эти вирусы приводят к формированию ясной и понятной клинической картины, либо патологоанатомической картины. Например, во время заражения мышей вирусом бешенства у них случается паралич. Большое количество вирусов хорошо вырастают в птичьих эмбрионах либо теле новорожденных млекопитающих. Реже в организме половозрелых особей.

              Культивируют вирус в организмах мышей, крыс, кроликов, кур. На взрослых особях мышей выращивают вирусы гриппа и бешенства.

              На белых крысах и хомяках испытывают онкогенные вирусы. Вирус ящура и маргбурской болезни культивируют на морских свинках. Ученые смогли изучить вирусы полиомиелита и желтой лихорадки только после того, как изучили их рост на макаках.

              Возбудителей некоторых инфекций ученые смогли определить только после заражения шимпанзе. К таковым относят вирусы гепатита А и В.

              Чтобы ученые получили верные результаты все животные, в организме которых культивируют вирусы, должны быть генетически однородными. Для достижения этой цели осуществляют скрещивание лабораторных особей. Результатом такого действия становится растущая степень гомозиготности.

              Чтобы культивирование прошло успешно, мало выбора правильного вида и возраста животного. Очень важно, какой будет использован путь для введения материала. Чаще всего вирусы вводят в чувствительные ткани. Лишь малая часть вирусов патогенна для животных независимо от способов введения.

              Большая часть нейротропных вирусов выращивают путем введения их в левое и правое полушарие головного мозга животных. Так происходит дело с культивированием вируса у мышей. Кроликам, мышам, овцам, собакам и другим животным аналогичным образом вводят вирус бешенства. Очень часто для культивирования вирусов использую и другой путь: через брюшную полость. Но по чувствительности такой способ уступает введению в головной мозг. Респираторные вирусы чаще вводят в организм интраназальным путем, то есть закапывают в нос или распыляют в виде аэрозоля.

              На сирийских хомячках культивируют аденовирус. Вводят его под кожу или в слизистую. В мышцу, через рот, в вену и через анальное отверстие вирусы вводят изредка. Внутривенное заражение произвести с грызунами и другими маленькими животными очень сложно. Вместо этого вирусы вводят прямо в сердечную мышцу.

              Осложняется культивирование вирусов в организме животных наличием внутри иных вирусов и бактерий. Иногда случается такое, что вирус в организме животного вырабатывает иммунитет к новому культивируемому.

              Чтобы снизить вероятность загрязнения культивируемых вирусов для введения материала используют выращенных в изоляции животных. Для этого выбирают животных, у матерей которых нет в организме инфекций, передающихся от матери к плоду. Новорожденных детенышей извлекают из тела матери, вводят в кишечник специальные молочнокислые бактерии. Для вскармливания таких малышей необходимы SPF самки. Затем уже между такими животными размножение осуществляется тем же путем. Содержатся малыши в закрытых помещениях, в которых осуществляется подача воздуха, свежей пищи и воды.

              Животные, в организме которых не имеется никаких возбудителей, содержатся в специально отведенных боксах, в строгой изоляции.

              Для культивирования вирусов подходят эмбрионы птиц. Для того, чтобы получить нужные результаты, необходимо правильно выбрать особь, ее вид и возраст, путь заражения и дозу. Температура инкубации играет также немаловажную роль. Из эмбрионов птиц чаще всего используют кур. Их организм до 13 дня отличается повышенной чувствительностью. Хорошо размножаются вирусы в желточном мешке, трахее и легких.

              Независимо от пути заражения эмбрионы могут быть травмированы. По этой причине гибель эмбрионов в течение суток после заражения вирусов, ученые не расценивают, как особенную. Обычно для размножения вируса в эмбрионе необходима температура от 36 до 37 градусов. Но для некоторых вирусных клеток необходима температура 40 градусов и выше.

              Размножаясь в организме эмбрионов вирусы могут приводить к гибели первых. Большую часть известных науке вирусов выращивают не только в организмах животных, но и в культурах клеток и тканей. В большинстве случаев для этих целей используют клеточные культуры на стекле. Суспензионные культуры используют очень редко. Адаптация вируса проходит легче к первичным культурам клеток, нежели к прививаемым. Для размножения человеческих вирусов лучше всего подходят клетки человека или почечные клетки обезьян.

              Доза для вируса при заражении должна составлять от 0,1 до 0,001 пятидесяти процентов тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. При это объем вводимого материала должен быть невелик. Через пару часов адсорбируют вирус, только после этого в случае токсичности инокулят удаляют.

              При размножении большинства вирусов наблюдаются цитопатические изменения. При дегенерации ¾ клеток в культуре наблюдают максимальное содержание вируса. Размножение вирусов, которые не обладают таким свойством, можно установить при помощи реакции гемадсорбции, путем проведения опытов на животных.

              Большая часть вирусных клеток после размножения выходят в культуральную среду, другие же так и остаются связаны с клетками. Некоторые герпетические вирусы пересевают наравне с неповрежденными клетками. Это обусловлено тем, что при разрушении последних осуществляется их инактивация. В некоторых случаях взаимодействие вируса и клетки приводит к развитию хронической болезни.

              Чтобы вырастить коронавирус человека, а также другие вирусы берут тканевые культуры. Чаще всего для этих целей используют ткани трахеи кролика. Понять о том, что вирус размножается можно по прекращению движения ресничек культуры ткани.

              Нельзя забывать о том, что в культурах клеток и тканей могут быть вирусы и микоплазмы. Попасть туда они могут различным способом.

              Для того, чтобы произошла адаптация вируса в искусственно созданных условиях, необходимо проведение нескольких пассажей. Чаще всего они последовательны при введении небольшого количества материала. Во время такой процедуры интенсивность культивирования вируса только растет. Адаптировавшись к одной системе, вирусы часто приобретают возможность размножаться в других системах. Те вирусы, которые выделены недавно, обладают повышенной пластичностью, нежели те, которые долго культивировались в других условиях.

              Следствием культивирования вируса в искусственных условиях становится уменьшение их патогенности для естественных владельцев. Такое их свойство положено в основу вакцинации. Если условия культивирования неблагоприятны, то в результате процесса могут появляться дефектные вирусные частицы. В них может содержаться лишь некоторая часть генома. Существуют вирусы, которые в искусственной среде культивировать и вовсе нельзя. После нескольких пассажей их репродукция прекращается.

              Вирусы сохраняют в особых условиях. Температура среды не должна быть меньше 4 градусов, а кислотность должна быть равна 7.0. При низкой температуре -70 и ниже вирусы сохраняются отлично. Для этого их помещают в плотно закрытые сосуды. При таких условиях хранения многие из них могут живут годами.

              Вирус оспы и энтеровирус хорошо хранится при температуре -20 градусов. Замораживают их быстро. Для их сохранения к среде добавляют стабилизаторы, которые на каждый вирус действуют неоднозначно.

              После лиофилизации вирусы могут жить на протяжении длительного промежутка времени. Стабилизаторы, которые применяют: молоко, пептон или куриный желток. Сохранение лиофилизированного вируса должно осуществляться в вакууме или нейтральном газе.

              Источники:

              http://researchpark.spbu.ru/methods-km-rus/233-metodiki-km1-rus

              http://www.dia-m.ru/blog/sovremennyy-podkhod-k-kultivirovaniyu-mikroorganizmov-i-kultur-kletok/

              http://studfile.net/preview/3096295/page:18/

              http://medicagroup.ru/publications/kultivirovanie-virusov-v-pitatelnyh-sredah/

              Читать еще:  Как выращивать кливию в домашних условиях
        Ссылка на основную публикацию
        Статьи c упоминанием слов:
        Adblock
        detector